（一）試劑貯存和準(zhǔn)備區(qū)

該工作區(qū)域如未設(shè)緩沖間，壓力應(yīng)為正壓。本區(qū)的功能是實驗室相關(guān)試劑(如核酸提取液、乙醇等)的配置和貯存(包括商業(yè)化的試劑，如PCR反應(yīng)緩沖液、Taq 酶和 dNTPs等)。當(dāng)試劑經(jīng)過技術(shù)性驗收符合要求后，為避免經(jīng)常打開保存管操作造成污染及反復(fù)的凍融，應(yīng)將試劑分裝貯存?zhèn)溆?/span>。貯存試劑的分裝體積根據(jù)實驗室內(nèi)一次測定所需的擴(kuò)增反應(yīng)數(shù)來確定。試劑應(yīng)按照其貯存條件進(jìn)行存放，通常為冰凍貯存。在本區(qū)的實驗操作過程中，操作者必須戴手套，并經(jīng)常更換。此外，操作中使用一次性帽子也是一個有效地防止污染的措施。嚴(yán)禁用嘴吸取液體，加樣器和吸頭等必須經(jīng)高壓滅菌處理。

（二）樣品制備區(qū)

該區(qū)域如未設(shè)緩沖間，壓力應(yīng)為負(fù)壓或減壓，可以安裝排風(fēng)系統(tǒng)。本區(qū)的功能為待檢樣品的保存、核酸的提取、貯存等。如在該區(qū)域內(nèi)還需進(jìn)行RNA檢測，應(yīng)辟出專門RNA操作區(qū)，或安裝二級生物安全柜或外排風(fēng)式的排風(fēng)櫥來替代。此區(qū)應(yīng)遠(yuǎn)離其他實驗操作區(qū)，粉碎樣品時的器皿要單獨(dú)使用，所有的器具在使用前須經(jīng)過徹底清洗并高壓消毒，防止交叉污染，稱取的待測試樣品應(yīng)加蓋后再轉(zhuǎn)移至PCR反應(yīng)配制區(qū)。

由于在加樣操作中可能會發(fā)生氣溶膠所致的污染，所以應(yīng)避免在本區(qū)內(nèi)不必要的走動。用于RNA擴(kuò)增檢測樣本制備好以后，應(yīng)立即進(jìn)行cDNA合成，因為cDNA鏈較RNA 穩(wěn)定，保存相對容易。為保證逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的需要，應(yīng)在樣品制備區(qū)設(shè)置溫育裝置。

（三）PCR反應(yīng)配制區(qū)

該區(qū)域如未設(shè)緩沖間，壓力應(yīng)為負(fù)壓或減壓，可以安裝排風(fēng)系統(tǒng)。本區(qū)的功能為配制、分裝PCR主反應(yīng)混和液以及加入核酸模板。已純化的核酸應(yīng)保存于-20°C或-80°C，避免反復(fù)凍融，陽性和陰性標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)DNA可調(diào)整至常用的濃度后分裝并冷凍保存。對于使用巢式PCR進(jìn)行檢測的實驗室，建議在此區(qū)域安裝二級生物安全柜或外排風(fēng)式的排風(fēng)櫥，第一輪的擴(kuò)增產(chǎn)物添加至第二輪的主反應(yīng)混和液的操作可以在此區(qū) 域進(jìn)行。

（四）擴(kuò)增區(qū)

該區(qū)域如未設(shè)緩沖間，壓力應(yīng)為負(fù)壓或減壓，可以安裝排風(fēng)系統(tǒng)。本區(qū)的功能為核酸擴(kuò)增。加了DNA或RNA等模板的反應(yīng)管應(yīng)蓋好蓋子后拿到本區(qū)域。

如未設(shè)置PCR反應(yīng)配制區(qū)，已制備的DNA、RNA模板或合成的cDNA(來自樣本制備區(qū))的加入和主反應(yīng)混合液(來自試劑貯存和制備區(qū))制備成反應(yīng)混合液等也可在本區(qū)內(nèi)進(jìn)行。在巢式PCR測定中，通常在第一輪擴(kuò)增后必須打開反應(yīng)管，因此巢式PCR擴(kuò)增有較高的污染危險性，第二次加樣必須在本區(qū)內(nèi)進(jìn)行。不能從本區(qū)再進(jìn)入任何”上游”區(qū)域。為避免氣溶膠所致的污染，應(yīng)盡量減少在本區(qū)內(nèi)的走動，如需要加樣則應(yīng)在超凈臺(氣流方向宜選擇垂流式)或生物安全柜內(nèi)進(jìn)行。打開預(yù)處理過的反應(yīng)混合液時必須防止液體濺出，尤其是在巢式PCR儀擴(kuò)增步驟之間。防止液體濺出的一個簡單的方法是在打開反應(yīng)管前快速離心數(shù)秒。

（五）擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū)

該區(qū)域如未設(shè)緩沖間，壓力應(yīng)為負(fù)壓或減壓，應(yīng)安裝排風(fēng)系統(tǒng)。本區(qū)的功能為擴(kuò)增產(chǎn)物的測定。此區(qū)是最主要的擴(kuò)增產(chǎn)物污染來源，應(yīng)遠(yuǎn)離其他實驗操作區(qū)，還應(yīng)注意避免通過本區(qū)的物品及工作服將擴(kuò)增產(chǎn)物帶出。在使用PCR-ELISA方法檢測擴(kuò)增產(chǎn)物時，必須使用洗板機(jī)洗板，廢液須收集至1mol/L HCl中，且不能在實驗室內(nèi)傾倒，應(yīng)至遠(yuǎn)離PCR實驗室的地方棄掉。用過的移液器吸頭也必須放至1mol/L HCl中浸泡后再放入垃圾袋中按程序處理。

?PCR 實驗室設(shè)備配置?

設(shè)備是實驗室硬件建設(shè)的基礎(chǔ)，是實驗室重要技術(shù)要素之一。實驗室能否準(zhǔn)確、客觀報告每一項檢測結(jié)果，正確選擇使用合適的設(shè)備是前提條件。在設(shè)施和環(huán)境條件滿足需要后，就要給PCR實驗室配備檢測所需要的儀器設(shè)備。PCR實驗室通常分為五個區(qū)域，每個區(qū)域都應(yīng)配備專用的儀器設(shè)備，并且應(yīng)加貼明確的標(biāo)識，避免不同區(qū)域內(nèi)的設(shè)備，特別是微量移液器等小設(shè)備發(fā)生混淆或誤用，從而造成環(huán)境 或樣品污染，

影響檢測結(jié)果。

（一）PCR實驗室常用設(shè)備種類

1. 溫控設(shè)備：包括冰箱(4°C，-20°C，-80°C)、恒溫水浴、恒溫箱和液氮罐等。

2. 水凈化設(shè)備：純水儀，用于制作符合分子生物學(xué)使用標(biāo)準(zhǔn)的去離子水或超純水。

3. 消毒設(shè)備：紫外燈、高壓鍋和干熱滅菌器等。

4. 量值設(shè)備:包括各種型號的移液器、量筒和pH計等。

5. 離心設(shè)備：如冷凍離心機(jī)、水平離心機(jī)和掌式離心機(jī)等。

6. 電泳設(shè)備：如電泳儀和電泳槽等，用于核酸和蛋白的檢測。

7. DNA熱循環(huán)儀(PCR 儀)：如普通PCR儀、梯度PCR儀、熒光PCR儀等，用于核酸的擴(kuò)增，可進(jìn)行定性和定量檢測。

8. 凝膠成像系統(tǒng)：用于電泳結(jié)果的觀察、拍照和分析。

9. 核酸蛋白分析儀：通過核酸和蛋白在紫外260 nm和280 nm有不同吸收峰的特性，用于核酸和蛋白的定量檢測及提取的DNA純度的檢測。

10. 制冰機(jī)：用于制造大多數(shù)核酸和蛋白的實驗操作所需的低溫環(huán)境，以減少核酸酶和蛋白酶的降解。

11. 微波爐：用于一些溶液的快速加熱。

12. 工作環(huán)境保障設(shè)備：生物安全柜、超凈工作臺等。

13. 超聲破碎儀：用于組織勻漿，樣品的提取。

14. 安全防護(hù)設(shè)備：用于緊急情況下實驗室及工作人員的安全防護(hù)，如洗眼裝置、緊急噴淋等。

（二）PCR實驗室各區(qū)域設(shè)備配置

（1）試劑儲存和準(zhǔn)備區(qū)

1. 4°C和-20°C冰箱

2. 混勻器

3. 掌式離心機(jī)

4. 微量移液器(覆蓋1uL-1000uL)

5. 移動紫外燈

（2）樣品制備區(qū)

1. 4°C和-20°C冰箱

2. 冷凍離心機(jī)

3. 混勻器

4. 水浴箱或加熱模塊

5. 生物安全柜或超凈工作臺

6. 超聲破碎儀

7. 超聲波水浴儀(如需處理大分子DNA，應(yīng)配備)

8. 純水儀

9. 微量移液器(覆蓋1uL-1000uL)

10. 可移動紫外燈

（3）PCR反應(yīng)配制區(qū)

1. -20°C冰箱或-80°C冰箱

2. 生物安全柜或超凈工作臺

3. 掌式離心機(jī)

4. 制冰機(jī)

5. 微量移液器(覆蓋1uL-1000uL)

6. 移動紫外燈

（4）擴(kuò)增區(qū)

1. DNA 熱循環(huán)儀(PCR 儀)

2. 生物安全柜或超凈工作臺臺(氣流方向宜選擇垂流式)

3. 微量移液器(覆蓋1uL-1000uL)

4. 可移動紫外燈

（5）擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū)

1. 電泳設(shè)備

2. 凝膠成像系統(tǒng)

3. 核酸蛋白分析儀

4. 微量移液器(覆蓋1uL-1000uL)

5. 可移動紫外燈

各個工作區(qū)域還應(yīng)該配備消耗品：一次性手套、一次性吸水紙、耐高壓處理的離心管和移液器吸頭; 專用工作服和工作鞋、清潔用具;專用辦公用品。以上這些物品應(yīng)保證在各自區(qū)域內(nèi)使用，不能交叉使用。

?PCR 實驗室質(zhì)量控制和質(zhì)量保證?

（一）實驗前的質(zhì)量控制

（1）人員

實驗操作人員應(yīng)具備良好的分子生物學(xué)專業(yè)技術(shù)操作規(guī)范。PCR 都是微量操作，要想獲得穩(wěn)定可靠的 檢測結(jié)果，操作人員就需要一定的專業(yè)技術(shù)知識與經(jīng)驗，要盡可能做到知其然又知其所以然。從實際工作 中來看，不同的操作者所獲得的測定結(jié)果往往差異也很大，因此，人員培訓(xùn)相當(dāng)重要，尤其是內(nèi)部針對性 的培訓(xùn)。

（2）環(huán)境

實驗室的設(shè)計和布局應(yīng)符合相關(guān)法律法規(guī)的要求，生物安全方面要符合 GB19489-2008 的規(guī)定。要將 不相容活動的相鄰區(qū)域進(jìn)行有效隔離，合理設(shè)計實驗室分區(qū)，進(jìn)入各個工作區(qū)域須遵循單一方向順序，即 只能從試劑貯存和準(zhǔn)備區(qū)、樣品制備區(qū)、PCR 反應(yīng)配制區(qū)、擴(kuò)增區(qū)至擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū)，防止不同區(qū)域間的 交叉污染對檢測結(jié)果造成的影響?？偨Y(jié)為一句話就是：嚴(yán)格遵守“各區(qū)獨(dú)立、單一方向”。對影響檢測質(zhì) 量的區(qū)域的進(jìn)入和使用，也要加以控制，非實驗有關(guān)人員和物品不能隨便進(jìn)入。

（3）儀器設(shè)備

儀器設(shè)備的正確使用、維護(hù)和校準(zhǔn)是保證 PCR 結(jié)果準(zhǔn)確的前提。對實驗室中的儀器設(shè)備，如擴(kuò)增儀、 離心機(jī)、移液器、生物安全柜等應(yīng)建立一套規(guī)范化、標(biāo)準(zhǔn)化的操作程序。各實驗區(qū)域應(yīng)有專用的儀器設(shè)備， 每臺設(shè)備要加貼唯一性標(biāo)簽，同一區(qū)域內(nèi)的儀器設(shè)備、物品和工作服應(yīng)有明顯標(biāo)記，避免與其他區(qū)域混用。

（4）試劑

PCR 實驗室使用的試劑等級應(yīng)為不含DNA和DNase的分析純或生化試劑(另有規(guī)定的除外)。試劑 到達(dá)實驗室后，需要經(jīng)過符合性驗收，關(guān)鍵試劑(包括核酸提取試劑、RNase、蛋白酶 K、陰性對照標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)、陽性對照標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)、Taq 酶、限制性內(nèi)切酶、引物、探針、菌種、陽性質(zhì)粒等)應(yīng)經(jīng)過技術(shù)性驗收，合格后方能使用。實驗用水應(yīng)符合一級水的規(guī)格，去離子水的電阻需達(dá)到18.2 Ω。商品試劑盒應(yīng)注明到貨日期，菌種、質(zhì)粒、動植物細(xì)胞組織的貯存和保管應(yīng)符合相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)和法律法規(guī)的要求。所有試劑應(yīng)按其規(guī)定的貯存條件存放。實驗室使用的試劑宜大體積配置、小體積分裝后高壓滅菌保存，不能高壓滅菌的試 劑應(yīng)過濾(0.22μm)除菌，PCR主反應(yīng)液、引物及探針應(yīng)避免反復(fù)凍融。配置的試劑應(yīng)在容器上標(biāo)明試劑名稱、濃度、配置時間、保存條件、失效日期、配制人等信息。

（5）樣品

實驗室收到的樣品時，應(yīng)確認(rèn)其包裝完好無損；進(jìn)入實驗室后應(yīng)加貼唯一性標(biāo)識；在對樣品進(jìn)行混和、樣品制備和稱量過程中要避免交叉污染。